同仁化学　相分離液滴 作製・観察スターターキット

コンポーネント	数量
BSA	10 mg ×1
BSA Dissolving Buffer (20 mmol/l HEPES pH7.4, 150 mmol/l NaCl)	×1
Assay Buffer (60 mmol/l HEPES pH7.4, 450 mmol/l NaCl)	×1
30% PEG8000 Solution	×1
Slide Glass with Double-Sided Tape	×2
Cover Glass	×4
1.5 ml Micro Tube	×4
0.5 ml Micro Tube	×4

• BSAを用いて相分離液滴の作製ができるオールインワンキット
• マイクロピペットと顕微鏡だけで液滴の観察が可能
• 計算例や操作詳細を記載した取扱説明書付

LLPS 研究をすぐにはじめられるキット

一般的にLLPS 研究を始める際には、細胞を用いない系で標的タンパク質が液滴を形成するかの確認を行うことが多いです。
しかしながらこのステップも、タンパク質によって最適条件は異なり、pH や塩の種類、クラウディング剤^※の有無など様々な検討事項や注意点があり、またさらに取り揃える試薬も多いため、初めての検討時には多くの労力がかかります。
同仁化学ではLLPS研究をこれからは始める方に最適な2種類のキットを準備しております。

• クラウディング剤（分子夾雑物再現剤）： 細胞内の混みあった環境を再現するために添加される、PEG やFicoll などの高分子。

• LL01 LLPS Starter Kit: 液滴作成法・観察方法の確認 (本製品)
• LL02 LLPS Forming Condition Screening Kit: 標的タンパク質液滴の最適条件の確認

作製・観察スターターキットを用いた時間経過によるBSAタンパク質の相分離液滴の観察

取扱説明書記載の方法でBSAの相分離液滴を作製し、蛍光顕微鏡(機種 : BZ-X710 : KEYENCE社)にて時間経過による変化を観察しました。

相分離液滴の融合の観察

相分離液滴であることを確認するために作成したBSA液滴の流動性を確認しました。LLPS Starter Kitを用いて作製したBSAの相分離液滴の融合の様子を、顕微鏡にて明視野観察しました。

• 使用顕微鏡： KEYENCE社 BZ-X710 (60倍率)

分離液滴の光退色後蛍光回復法(FRAP)測定

FRAP測定は液滴を構成するタンパク質に蛍光タンパク質や蛍光色素で標識し、作製した液滴の一部をレーザーで退色させ、その蛍光が時間経過により回復するかを観察する方法です。退色させた液滴に流動性がなければ、退色した部分はそのままです。それに対し、液滴が流動性のある相分離液滴であれば退色した部分に周りの分子が入って蛍光が回復してくるため、相分離液滴の確認方法として汎用されています。本キットと同仁化学製品(LK01) Fluorescein Labeling Kit – NH₂を使用してFRAP測定を行った例を以下に掲載します。
蛍光色素を標識したBSAを用いて相分離液滴を作製し、30分後にFRAP測定を行いました。​レーザー照射後、退色した液滴の蛍光が回復する様子が観察できました。

• 本実験のBSAの終濃度は100 µmol/lとした。また蛍光色素標識BSAが0.5%含まれるように調製した。
• 蛍光色素の標識には、 BSA 100 µgに対し、(LK01) Fluorescein Labeling Kit – NH₂ 1 sampleを用いて標識した。​
• 使用顕微鏡：Zeiss社 LSM 8 (63倍率)、 Ex: 488 nm / Em: 500-600 nm, 0.5%, 500V