Genovis社 ImpaRATOR
Genovis社は、モノクローナル抗体、ADCs(antibody drug conjugates)、Fc融合タンパク質、バイオシミラー等のバイオ医薬品の研究開発に使用できるユニークな酵素(プロテアーゼ、グリコシラーゼ、シアリダーゼなど)を用いた製品をラインアップしています。
ImpaRATORは糖タンパク質内でO-グリコシル化されたセリンまたはスレオニン残基のN末端側のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼです。様々な構造のO型糖鎖を認識する基質特異性の広さが特長であり、糖鎖の脱シアリル化等の前処理が不要です。一方で、N型糖鎖には作用しません。ImpaRATORによりインタクトなグリコペプチドが得ることができ、O型糖鎖のプロファイリング、占有部位の同定、O型グリコペプチドのマッピングに有用な酵素です。
ImpaRATORの特長
- O-グリコシル化されたSer/ThrのN末端を切断するO-グリカン特異的なプロテアーゼ
- 様々な構造のO型糖鎖に作用する幅広い基質特異性
- インタクトなO型糖鎖が取得可能
ImpaRATORの基質特異性
前処理によりグリカン構成を変化させた3種類のエタネルセプトを基質にImpaRATORを反応させ、O型糖鎖に対する基質特異性を確認しました。下図はImpaRATORまたはOpeRATORにて処理したサンプルをHILIC-MSにて分析した結果です。ImpaRATORは3種類の基質すべてに対して十分な活性を示しました。
ネイティブなエタネルセプトをImpaRATORにて処理(a)すると、他のサンプルと比較してより多様なグリコペプチドが検出されます。モノシアリル化またはジシアリル化されたcore 1構造のグリカンが主に観察されました。また、SialEXOにて前処理されたエタネルセプトをImpaRATORで処理(b)とOpeRATORで処理(d)したサンプルを比較すると、core 1構造を持つグリコペプチドはどちらのサンプルでも確認され、Tn抗原を持つペプチドはImpaRATORで処理したサンプルでのみ確認されました。また、SialEXO及びGalactEXOで前処理したエタネルセプトをImpaRATOR処理(c)すると、Tn抗原を持つペプチドのみが検出されました。
このように本データから、Imparatorはcore 1、シアリル化されたcore 1、Tn抗原と、様々な構造の糖鎖に対して幅広く作用することが示されました。
a) 未処理 Etanerceptを ImpaRATORにて消化
b) SialEXO処理 Etanerceptを ImpaRATORにて消化
c) SialEXOとGalactEXO処理 Etanerceptを ImpaRATORにて消化
d) SialEXO処理 EtanerceptをOpeRATORにて消化
ImpaRATORとOpeRATORによる糖鎖マッピング
ImpaRATORとOpeRATOR (+ SialEXO)をそれぞれ使用した際の、エタネルセプト内のO-グリコシル化部位のカバレッジを評価しました。OpeRATOR（+SialEXO）では13カ所すべてのO型糖鎖がカバーできるのに対し、ImpaRATORでカバーできたのは10カ所のみでした。ImpaRATORではS186、T245、T213が消化されないことから、ImpaRATORはOpeRATORと比較してアミノ酸配列選択性があり、またO-グリコシル化されたアミノ酸が隣接する場合に活性が低いことが分かります。
OpeRATORは活性化にシアル酸の除去が必要であり、幅広くグリコペプチドが得られるものの、糖鎖のシアリル化の有無等の情報は得られません。一方で、ImpaRATORは反応性の低い配列があるものの、シアリル化された糖鎖にも活性を示すためインタクトな糖鎖の情報を取得できます。ImpaRATORとOpeRATORの両方からプロファイルを取得することで、グリカン構成とO-グリコシル化部位の両方の情報を完全に網羅することができます。
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