Genovis社 OpeRATOR™

• 糖タンパク質のO型糖鎖修飾部位のSer/ThrのN末端を特異的に切断
• 同封のSialEXO™(シアリダーゼ)の併用により、活性を高める
• N型糖鎖修飾部位には作用しない

• 
  • SialEXO™がシアル酸を除去
  • OpeRATOR™酵素がO型糖鎖結合Ser/Thrを認識

• OpeRATOR™酵素
  ＋
  SialEXO™酵素
  

• 
  • O型糖鎖が結合したSer/ThrのN末端を特異的に切断

天然型O-グリコシル化TNF受容体（TNFR）をOpeRATOR™、SialEXO™、または両方を添加しインキュベートしたサンプルをSDS-PAGEで分析した。

PNGaseF(N-グリコシダーゼF)でO型糖鎖修飾部位を1つ持つEPO(~30kDa)からN型糖鎖を除去し、SialEXO™(シアリダーゼ、OpeRATOR™製品に添付)でシアル酸を除去するとともに、並行してOpeRATOR™によりO型糖鎖(core 1) 修飾SerのN末端側を加水分解した。DDTにより還元後、得られた2つのフラグメントをRP C4カラムで分離し、Bruker Impact II ESIQTOFMSで解析した。a) UV trace b) QTOF MS

高度にO型糖鎖修飾されたFc融合型タンパク質であるエタネルセプトをOpeRATOR™で消化し、得られた糖ペプチドをLC-MS/MSで分析したところ、タンパク質のO型糖鎖修飾の不均一性とO型糖鎖構造に対するOpeRATOR™の特異性により、配列が重複するペプチドが形成され、O型糖鎖部位の完全なマップを作成できた。

OpeRATOR™とSialEXO™は同時に反応させることができますか？

はい、これら2つの酵素は組み合わせて使用し、O型糖鎖修飾タンパク質の脱シアル化と消化が可能です。

OpeRATOR™の阻害剤はありますか？

OpeRATOR™はメタロプロテアーゼ(触媒機構に金属が関与するプロテアーゼ)であるため、EDTAなどのキレート剤に敏感で5 mMを超える濃度では完全に阻害されます。また、ZnCl₂によってもある程度の阻害を受けます。

サンプルは本来の立体構造を維持していることが必要ですか？それとも変性させた方がよいですか？

OpeRATOR™による消化が不十分な場合、サンプルであるタンパク質のO型糖鎖がOpeRATOR™が結合できない位置に存在する可能性があります。
このような場合、下記のワークフローをおすすめします。
→ 還元、変性、カルボメチル化、Rebufferingの後、SialEXO™とOpeRATOR™による消化

OpeRATOR™はヘキソースやペントース単体に作用しますか？

いいえ、OpeRATOR™はヘキソース糖に結合したGalNAcによるムチン型糖鎖修飾を認識します。

シアル酸の除去は必要ですか？

OpeRATOR™の活性はシアル酸の存在下では大幅に低下します。シアル酸の除去にはSialEXO™をおすすめします。SialEXO™を使用したくない場合は、SialEXO™を使用する場合としない場合の両パターンでサンプルを消化し、サンプルへの影響を評価することをおすすめします。