SARS-CoV / SARS-CoV-2 抗ウイルス薬探索に

SARS-CoV / SARS-CoV-2 Main Protease 活性測定用蛍光基質

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) が宿主細胞に感染すると、ウイルス由来のRNAから巨大な前駆体タンパクが翻訳されます。その前駆体タンパクは種々のプロテアーゼによって切断され、例えばRNA依存的RNAポリメラーゼなどのウイルスの増殖に必要な機能タンパクとなります。
SARS-CoV-2 Mproは切断産物の一つでもありますが、前駆体タンパク切断の主要な役割を担っており、ウイルスの増殖に必要不可欠なプロテアーゼです。従って、この「メインプロテアーゼ」の阻害剤は抗ウイルス薬となる可能性があり、世界中で開発が進められています。
ペプチド研究所ではSARS-CoV main protease (SARS-CoV Mproまたは3CLpro) ・SARS-CoV-2 main protease (SARS-CoV-2 Mpro) の基質3種類をラインアップしております。メインプロテアーゼが基質を切断することによって増加する蛍光を観測することで、プロテアーゼ活性を測定することができます。阻害剤探索研究などにお役立てください。

Dabcyl-Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met-Glu(Edans)-NH2

SARS-CoV / SARS-CoV-2 MproのFRETを利用した消光性蛍光基質です1),2),3)。前駆体タンパクの配列Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln↓Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met [↓が切断部位] に蛍光基(Edans基)と消光基(Dabcyl基)を導入しています。SARS-CoV Mproが蛍光基と消光基間のGln-Ser配列を切断すると、蛍光が増大します。この蛍光を観測することにより、プロテアーゼ活性を測ることができます。
[KM=17 μM、kcat=1.9 s-1 (SARS-CoV Mproに対する速度論的パラメータ)]1)
[KM=33 μM (SARS-CoV-2 Mproに対する速度論的パラメータ)]3)

 

図1.FRETを利用したSARS-CoV/SARS-CoV-2 Mpro消光性蛍光基質のプロテアーゼ活性測定方法

Ac-Abu-Tle-Leu-Gln-MCA・Ac-Thz-Tle-Leu-Gln-MCA

Dragらにより報告された、SARS-CoV-2 Mproへの親和性の高い2つの配列4)にアミノメチルクマリン(AMC)を導入した、4-メチルクマリン-7-アミド(MCA)タイプの蛍光基質です。非蛍光物質であるMCA基質が、SARS-CoV-2 Mproにより切断されると、強い蛍光をもつAMCが遊離します。この蛍光を観測することにより、プロテアーゼ活性を測ることができます。(Ex: 380nm / Em: 460nm)

参考文献

  1. C.-J. Kuo, Y.-H. Chi, J.T.-A. Hsu, and P.-H. Liang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 318, 862 (2004).
  2. L. Zhang, D. Lin, X. Sun, U. Curth, C. Drosten, L. Sauerhering, S. Becker, K. Rox, and R. Hilgenfeld, Science, 368, 409 (2020).
  3. C. Ma, M. D. Sacco, B. Hurst, J. A. Townsend, Y. Hu, T. Szeto, X. Zhang, B. Tarbet, M. T. Marty, Y. Chen, and J. Wang, bioRxiv2020.04.20.051581.
  4. W. Rut, K. Groborz, L. Zhang, X. Sun, M. Zmudzinski, R. Hilgenfeld, and M. Drag, bioRxiv2020.03.07.981928.

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