ペプチド研究所 SARS-CoV/CoV-2 Main Proteases用蛍光基質
Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) が宿主細胞に感染すると、ウイルス由来のRNAから巨大な前駆体タンパクが翻訳されます。その前駆体タンパクは種々のプロテアーゼによって切断され、例えばRNA依存的RNAポリメラーゼなどのウイルスの増殖に必要な機能タンパクとなります。
SARS-CoV-2 Mproは切断産物の一つでもありますが、前駆体タンパク切断の主要な役割を担っており、ウイルスの増殖に必要不可欠なプロテアーゼです。従って、この「メインプロテアーゼ」の阻害剤は抗ウイルス薬となる可能性があり、世界中で開発が進められています。
ペプチド研究所ではSARS-CoV main protease (SARS-CoV Mproまたは3CLpro) ・SARS-CoV-2 main protease (SARS-CoV-2 Mpro) の基質3種類をラインアップしております。メインプロテアーゼが基質を切断することによって増加する蛍光を観測することで、プロテアーゼ活性を測定することができます。阻害剤探索研究などにお役立てください。
Dabcyl-Lys-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met-Glu(Edans)-NH2
SARS-CoV / SARS-CoV-2 MproのFRETを利用した消光性蛍光基質です1),2),3)。前駆体タンパクの配列Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln↓Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-Met [↓が切断部位] に蛍光基(Edans基)と消光基(Dabcyl基)を導入しています。SARS-CoV Mproが蛍光基と消光基間のGln-Ser配列を切断すると、蛍光が増大します。この蛍光を観測することにより、プロテアーゼ活性を測ることができます。
[KM=17 μM、kcat=1.9 s-1 (SARS-CoV Mproに対する速度論的パラメータ)]1)
[KM=33 μM (SARS-CoV-2 Mproに対する速度論的パラメータ)]3)
図１．FRETを利用したSARS-CoV/SARS-CoV-2 Mpro消光性蛍光基質のプロテアーゼ活性測定方法
Ac-Abu-Tle-Leu-Gln-MCA・Ac-Thz-Tle-Leu-Gln-MCA
Dragらにより報告された、SARS-CoV-2 Mproへの親和性の高い2つの配列4)にアミノメチルクマリン(AMC)を導入した、4-メチルクマリン-7-アミド(MCA)タイプの蛍光基質です。非蛍光物質であるMCA基質が、SARS-CoV-2 Mproにより切断されると、強い蛍光をもつAMCが遊離します。この蛍光を観測することにより、プロテアーゼ活性を測ることができます。(Ex: 380nm / Em: 460nm)
参考文献
- C.-J. Kuo, Y.-H. Chi, J.T.-A. Hsu, and P.-H. Liang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 318, 862 (2004).
- L. Zhang, D. Lin, X. Sun, U. Curth, C. Drosten, L. Sauerhering, S. Becker, K. Rox, and R. Hilgenfeld, Science, 368, 409 (2020).
- C. Ma, M. D. Sacco, B. Hurst, J. A. Townsend, Y. Hu, T. Szeto, X. Zhang, B. Tarbet, M. T. Marty, Y. Chen, and J. Wang, bioRxiv2020.04.20.051581.
- W. Rut, K. Groborz, L. Zhang, X. Sun, M. Zmudzinski, R. Hilgenfeld, and M. Drag, bioRxiv2020.03.07.981928.
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