ニッポンジーン　Cas9タンパク質

ヒトiPS細胞の遺伝子ノックイン 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　※ 本実験データは、株式会社 特殊免疫研究所 様からご提供いただきました。

Cas9 Nuclease protein NLS(15 µg/µL)を使用し、エレクトロポレーション(EP)法でヒトiPS細胞2101B7株へ導入し、ノックイン細胞株を作製した。 ノックインには、標的遺伝子XXにある制限酵素HindIIIサイトの中にEcoRIサイトを付加した150 nt のノックインドナーDNA(一本鎖オリゴヌクレオチド：ssODN)を使用した。

エレクトロポレーション法(EP)でトランスフェクション

装置 細胞数 使用製品 セレクション

：4D-Nucleofector (Lonza) ：0.5 x 106 cells/EP ：Cas9 Nuclease protein NLS (15 µg/µL) 100 pmol ：限界希釈・ピックアップ

全アレルノックイン(ホモKI)候補サンプル例

ゲノム編集により、制限酵素HindIIIサイトがある標的配列にノックアウト(KO)、ノックイン(KI)などの遺伝子変異が生じると、HindIIIでは切断されない。ssODNには制限酵素EcoRIサイトを付加しているため、ssODNによるノックイン(KI)に成功すると、EcoRIによって切断されるバンドが生じる。
したがって、上図において両アレルノックイン(ホモKI)候補は、6、16、21レーンのサンプルである。

iPS細胞ノックイン細胞株のシークエンス解析

野生型配列とのアラインメント
両アレルノックイン(ホモKI)候補サンプルの変異領域についてシークエンス解析を行い、ノックイン細胞株であることを確認した。野生型アレルの制限酵素HindIIIサイト(AAGCTT)配列の中に、制限酵素EcoRIサイト(GAATTC)がノックインされている。

結果：Cas9 Nuclease protein NLS(15 µg/µL)を用いて、ヒトiPS細胞のノックイン細胞株(EcoRIサイト導入)を得ることができた。

Cas9 Nuclease protein NLS (3 µg/µl) を用いたノックインマウスの作出　　　　※ 本実験データは、株式会社 特殊免疫研究所 様からご提供いただきました。

マウスSmpd3 遺伝子を標的として、本製品とgRNAおよびノックインドナーDNA(一本鎖オリゴヌクレオチド：ssODN)を混合し、C57BL/6Jマウス受精卵の前核と細胞質にマイクロインジェクションした。マウス 2細胞期胚を仮親に移植し、誕生した仔マウスについて遺伝子ノックインの有無を確認した。

A）Surveyorアッセイによる変異導入(ノックアウト)の確認

Surveyor assay (Cel-I ヌクレアーゼアッセイ) では、Cas9 の導入によりノックアウト、ノックインなどの遺伝子変異が導入された改変体個体をバンドシフトによりスクリーニングすることができる。本実験では、誕生した仔マウス11匹のうち6匹のサンプルにおいて、Cel-Iヌクレアーゼにより切断されたPCR産物が観察された(矢印, 下左図)。

B) PCR-RFLPによる変異導入(ノックイン)の確認

ドナーDNA（ssODN）に予め制限酵素（BamHⅠ）サイトを付加した。得られたPCR産物をBamH I で消化したところ、Surveyor assay で陽性検出された変異体候補サンプルで、切断断片が観察された（矢印, 下右図）。

結果：誕生した11匹の仔マウスのうち 6匹のマウスにおいて遺伝子ノックインが確認された。
　　　このことから、Cas9 Nuclease protein NLS を用いて効率良く遺伝子ノックインを行えたことが分かった。

特長