同仁化学　Calcium Kitシリーズ

細胎内カルシウム動態をモニタリングする蛍光プローブは、カルシウムイオン選択的な錯休形成挙動を示すBPTA構造を特っており、Fura 2、Fluo 4、Rhod 2 など様々なものがあります。

インフィニットM200と同仁化学研究所の細胎内カルシウム測定キットとを組み合わせることにより、細胎内カルシウム動態をリアルタイムにモニタリングすることが可能です。

細胞内カルシウム測定キット Calcium Kit-Fluo 4 Calcium Kit-Fura 2

洗浄のいらない細胞内カルシウム測定キット Calcium Kit II-Fluo 4 Calcium Kit II-Fura 2

本キットは、細胎内カルシウム測定において広く利用されているFluo 4-AMまたはFura 2-AM、各種試薬およびBufferをセット化したマイクロプレートリーダー測定に対応したキットです。

また、各カルシウムプローブに対し、測定系に影響の少ない Washタイプ(Calcium Kit)と洗浄操作が不要な Non Washタイプ(Calcium Kit II)を取り揃え、測定系に応じて選択できるようになっています。

各キットには、カルシウムプローブの溶解補助剤である界面活性剤2種類とカルシウムプローブの細胞からの漏れ出しを防止する陰イオントランスポーター阻害剤1種類が入っており、細胞種々添加する薬剤に応じてそれぞれの試薬の各濃度を任意で設定することができます。

Bufferも添付しておりますので別途試薬を準備する必要はありません。

Calciumu Kit II には、バックグランド蛍光を消光するQuenching Bufferが入っており、洗浄操作をせずに測定することが可能です。ただし、細胞種や添加する薬剤によってはQuenching Bufferが測定結果に影響する可能性もあります。

アッセイ系に応じて Washタイプ(Calcium Kit)とNon Wash タイプ(Calcium Kit II)を選択ください。

• マイクロプレートリーダーによる多検体同時カルシウムアッセイ可能
• 96ウェル、384ウェルプレート測定に対応
• WashタイプとNon Wash タイプ(Quencher入り)の2種類から選択可能

• Calcium Kit（Fluo 4、Fura 2 共通）Washタイプ

  Fluo 4-AM(Fura 2-AM)	50 µg x 10
  Dimethylsulfoxide	2 mL x 1
  5％ Pluronic F-127	2.5 mL x 1
  5％ Cremophor EL	2.5 mL x 1
  250 mmol/L Probenecid	1.3 mL x 1
  Recording Medium(2x)	100 mL x 1

• Calcium Kit II（Fluo 4、Fura 2 共通）Non Washタイプ

  Fluo 4-AM(Fura 2-AM)	50 µg x 10
  Dimethylsulfoxide	2 mL x 1
  5％ Pluronic F-127	2.5 mL x 1
  5％ Cremophor EL	2.5 mL x 1
  250 mmol/L Probenecid	1.3 mL x 1
  Hank's HEPES Buffer(10x)	6 mL x 1
  Quenching Buffer	55 mL x 1

Fluo 4-AM の蛍光特性

励起波長:495nm、蛍光波長:518nm、Ca錯休解離定数(Kd) : 360nmol/l

測定原理

Fluo 4-AM は細胎内への移行を容易にするため、脂溶性のアセトキシメチル基が導入されています。 Fluo 4-AM を培地中に添加すると容易に細胎内に取り込まれ、細胎内のエステラーゼにより分解されます。加水分解された水溶性のFluo 4 は細胞膜を透過しにくくなり、細胎内に拡散します。 Fluo 4 の状態ではカルシウムと錯体形成して強い蛍光を発するようになります。

細胞内Ca測定法

アッセイプロトコール

1. 細胞の浮遊液を調整し、1 wellあたり40,000 cells/100 µLとなるようプレートに分注し、CO₂インキュベーターで一晩培養する。
2. 細胞を傷つけないよう培地を除去する。
3. 100 µL/well の Loading Buffer^※を、それぞれの well に加える(必要に応じて Loading Buffer を添加する前に37℃に加湿したPBSで細胞を洗浄して下さい。)
4. 37℃で1時間インキュベートする。
5. 細胞を傷つけないように Loading Buffer を除去する。
6. 予め37℃に加湿しておいた Recording Medium を、100 µL/well ずつ加える(必要に応じて Recording Medium を添加する前に37℃に加湿したPBSで細胞を洗浄してください。)
7. 薬剤添加による蛍光強度変化をインフィニット M200 にて測定する。

• Loading Buffer : Recording Medium 10 mL に Fluo 4-AM DMSO solution 50 µL 添加。
  必要に応じて細胎内へカルシウムプローブを取り込みやすくする界面活性剤 Pluronic F-127、細胞からカルシウムプローブを漏れ出しにくくする Probenecid を添加。

CHO細胞へATP(25μM)による刺激を与えた場合のカルシウムイオン濃度変化

• 

• CHO細胞を用いて、ATPを10秒後に添加し、その蛍光変化からカルシウムイオン濃度をモニタリングした。

  インフィニットM200はインジェクターを備えることが可能なため、薬剤によるカルシウムイオン濃度変化がリアルタイムで確認できる。また、モノクロメーターでの波長設定のため、更に蛍光特性に合致した波長の測定が可能であり、より高い蛍光強度での検出が可能である。

Fura 2-AM の蛍光特性

アッセイプロトコル

1. 細胞の浮遊液を調整し、1well あたり40,000 cells/100 µLとなるようプレートに分注し、CO₂インキュベータで一晩培養する。
2. 細胞を傷つけないよう培地を除去する。
3. 100 µL/well の Loading Buffer^※を、それぞれの well に加える(必要に応じて Loading Buffer を添加する前に37℃に加湿したPBSで細胞を洗浄してください。)
4. 37℃で1時間インキュベートする。
5. 細胞を傷つけないように Loading Buffer を除去する。
6. 予め37℃に加湿しておいた Recording Medium を、100 µL/well ずつ加える(必要に応じて Recording Medium を添加する前に37℃に加湿したPBSで細胞を洗浄して下さい。)
7. 薬剤添加による蛍光強度変化をインフィニット M200 にて測定する。

• Loading Buffer : Recording Medium 10ml に Fura 2-AM DMSO solution 50μl 添加。
  必要に応じて細胎内へカルシウムプローブを取り込みやすくする界面活性剤 Pluronic F-127、細胞からカルシウムプローブを漏れ出しにくくする Probenecid を添加。

CHO細胞へATP(1 µM)による刺激を与えた場合のカルシウムイオン濃度変化