ヒトiPS細胞およびがん細胞の遺伝子改変サービス

単一遺伝子DNMT ３Aに対するガイドRNAを作製し細胞に導入後にシーケンス確認を行った。

ホモ変異株の取得
　A25株　DNMT3Aシークエンス結果
　PCRプロダクトをダイレクトシークエンス解析

使用したiPS細胞株 特殊免疫研究所にて樹立したiPS細胞株（Epi5により初期化されたPBMC由来細胞）

遺伝子改変技術：CRISPR/Casシステム利用
遺伝子導入法 エレクトロポレーション（4D-Nucleofetor）
選抜方法：Puromycin選抜
gRNAデザイン：gcatgatgcgcggcccaagg agg （ ex20をターゲット）
　　　　　　　　　　　　target　　　 PAM

※参考資料 Liao,Jing, et al. Nature genetics 47. 5（2015） : 469-478

DNMT3AおよびDNMT3Bをターゲットに両遺伝子に対するガイドRNAを設計し同時にトランスフェクションした。

作業結果	ピックアップ数 11クローン DNMT3Aのみ変異 3クローン & DNMT3Bのみ変異2クローン DNMT3A、3Bともに変異 3クローン　ダブルノックアウトホモ1クローン確認

使用したiPS細胞株 特殊免疫研究所にて樹立したiPS細胞株（Epi5により初期化されたPBMC由来細胞）

遺伝子改変技術：CRISPR/Casシステム利用
遺伝子導入法 エレクトロポレーション（4D-Nucleofetor）
選抜方法：Puromycin選抜
DNMT3A gRNAデザイン：gcatgatgcgcggcccaagg agg （ ex20をターゲット）
　　　　　　　　　　　　　　　　target　　　　PAM
DNMT3B gRNAデザイン：gaatgataaactcgagctgc agg （ ex21をターゲット）
　　　　　　　　　　　　　　　　target　　　　PAM

※参考資料 Liao,Jing, et al. Nature genetics 47. 5（2015） : 469-478

工程	作業内容	1件あたり費用
工程1	遺伝子導入 　　株化細胞をご提供いただきます（融解、培養、増殖、継代） 　　　　弊社への細胞導入のための微生物検査 　　　　遺伝子導入_Cas9_gRNA発現プラスミド 　　（通常2つの条件で遺伝子導入を実施） 　　播種、細胞培養	￥400,000
工程2	細胞セレクション 　　プラスミド導入後、限外希釈によるサブクローン化作業 　　培養、増殖、継代 　　100クローンを目標に作業を行います。	￥800,000
工程3	解析（ゲノム抽出から遺伝子解析まで） 　　取得した全クローンからゲノム抽出します 　　抽出したゲノムDNAを用いてsurveyor assay（またはPCRスクリーニング） 　　による遺伝子変異の確認 　　遺伝子変異を確認できた株のシークエンス解析を行います。	￥400,000
工程4	エキスパンド作業-凍結保存 　　選抜されたクローンを培養、継代による細胞の増殖を行います。 　　細胞の増殖作業を終えた後、バイアル作製 　　1バイアルあたり、5×106～1×107 cell/mL	￥50,000
注意事項	限界希釈法による細胞株取得作業が困難と判断した場合、ご依頼者様と協議の上、細胞株の純化作業を進めます。 （薬剤耐性遺伝子の使用の有無等） 工程3にて目的の細胞株が得られていないと確認された場合、ご依頼者様と協議の上、作業を再度実施いたします。
ヒトiPS細胞のノックアウト細胞の樹立の場合は2,470,000円となります。		￥1,650,000

• 凍結保存細胞バイアル1本（3×106cell）
• ＰＣＲ、またはＳｕｒｖｅｙｏｒ　ａｓｓａｙによる遺伝型解析
• ターゲット領域のシークエンス確認