リアルタイム定量PCR（qPCR）解析

• リアルタイム定量PCRを実施し、検体に含まれるさまざまな遺伝子発現量を評価することができます。
• 検体をお預かりし、Repertoire Genesisにてtotal RNA抽出、cDNA合成、特異的プライマーセットおよびスタンダードサンプルを用いてリアルタイム定量PCRを実施し、データ集計（複数群の場合は群間の統計処理）、報告書を納品致します。
• ヒトおよびマウスにおいて、一般的な項目（CD3、CD4、CD8、IFNg、TNFa、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10等）を揃えております（他の項目につきましてはお問い合わせください）。

免疫応答に関連する遺伝子の発現量を評価する方法としてFACS（フローサイトメトリー）解析が昔から使われていますが、多くの細胞数が必要であること、細胞内発現タンパク質について評価することが難しいなど、いくつかの制限がありました。そのような中、タンパク質の発現量とmRNAの発現量は相関することが知られており、また細胞間で発現量が安定している標準遺伝子（ハウスキーピング遺伝子：HKG）を補正値として用いることで、正確に免疫関連遺伝子の活性化（発現量の増加等）を評価できるようになりました。

まず検体より抽出したTotal RNAを逆転写酵素によりcDNA合成します。次にmRNAとgDNAと見分けるために複数のエクソンをまたぐ形で設計された対象遺伝子特異的プライマーを用いて、また蛍光を発する試薬（SYBR Green I）をPCR系に加えるインターカレーター法を利用することで、PCR増幅の過程を撮影し、取得された蛍光強度から遺伝子の増幅量を推測します。また、あらかじめ対象遺伝子を精製し濃度が判明しているスタンダードサンプルを同時に解析することで、検体の遺伝子発現量をコピー数として算出することができます（図）。

• TCR/BCRレパトア解析とあわせた免疫学的機能解析

レパトア解析によって、活性化している特異的T細胞を特定した後、さらにそのT細胞集団がどのような免疫学的性質を示しているか調べることができます。例えば炎症部位において細胞性免疫が関与する場合、ソートサンプルを用意しなくても本解析によりCD4やCD8の割合、Th1もしくはTh2型のサイトカインの産生プロファイルを評価することができます。

• ご希望の遺伝子について発現状況を確認

マイクロアレイを実施するには検体数が多く、測定したい項目は多くないなど、小回りが利く実験に適しています。評価したい遺伝子情報をお伝え頂き、弊社に検体を発送するだけで、その後の特異的プライマー設計、スタンダードサンプル作成等は、弊社で承ります。

Total RNAが安定化されている検体、抽出済Total RNA

RNAは大変分解されやすいものです。検体は必ずRNA later等のRNA 安定化試薬に浸漬保存してください。詳しい検体採取方法につきましては、Repertoire Genesisのホームページより検体採取プロトコールが入手できますので、必ずご参照ください。

• 納品書、解析報告書
• DVD（qPCR解析データ、統計処理データ）

実施例

リアルタイム定量PCR（qPCR）解析時に確認される増幅曲線（左）と増幅の特異性を評価するメルトカーブ（中）。プライマーダイマーなどの非特異産物と区別して解析することができる。

スタンダードサンプルを基準として、検体の遺伝子発現量を算出した場合、表現方法の一例として上図のようなグラフを作成できる。 複数の群においてある程度のn数をもってqPCR解析を実施することで、統計学的に有意な結果を得ることができる。