ArgenTag社 Single-Cell RNA Library Kit for LRS
『Single-Cell RNA Library Kit for LRS』はPacific Biosciences (PacBio)社やOxford Nanopore (ONT)社シーケンサーによるLong-Read Sequencing (LRS) でシングルセルRNA-Seq (Single-Cell RNA-Seq : scRNA-Seq)を可能にするためのcDNAを合成するキットです。Long-Read scRNA-Seq解析をすることでｍRNAの長距離情報を得ることができるため、スプライシングによる各種アイソフォームの解析が可能となります。
製品概要
『Single-Cell RNA Library Kit for LRS』はPacific Biosciences (PacBio)社やOxford Nanopore (ONT)社シーケンサーによるLong-Read Sequencing (LRS) でシングルセルRNA-Seq (Single-Cell RNA-Seq : scRNA-Seq)を可能にするためのcDNAを合成するキットです。
原理
本製品はマイクロ流体チップを使用することで細胞を分画、溶解し、細胞内のmRNAを補足します。
操作は主にキットに含まれているマイクロ流体チップで行われるため、特別な機械は必要ありません。
*細胞の分画にはポアソン分布に従っています。
各マイクロウェルに細胞が分画した後にmRNAを補足するためのバーコードビーズも同様に各マイクロウェルに分画します。ビーズの表面には増幅用の”P配列“、”Barcode配列”、cDNA定量用の”UMI”、”ポリ(d)T配列”を含むオリゴ核酸が存在しています。細胞が溶解されると細胞内のmRNAがビーズ表面のポリ(d)T配列とハイブリダイズし、補足されます。
捕捉されたmRNAはマイクロ流体チップから回収され逆転写反応によりcDNAに変換されます。合成されたcDNAには各マイクロウェル由来のユニークバーコードとUMI配列が付加されています。
P配列と逆転写反応時に付加されたTSO(Template Switching Oligo)配列により完全長のcDNA増幅が可能となります。
*本製品はcDNA合成および複製までの操作となります。scRNA-SeqにはPacBio社もしくはONT社のライブラリー調製キットが別途必要となります。
ONT 『SQK-LSK114』 もしくは PacBio 『Kinnex full-length RNA』を用いてライブラリーを調製する必要があります。
*本製品はラン2回分となります。
ONT：PromethION 2 と PacBio：Sequel®ⅡもしくはRevio™ System のシーケンサーに対応しています。
＜解析データ＞
- ONT：
- 1回の反応ごとに1枚のP2フローセル（50-100 Gb/Flow Cell) から出力されたデータが解析対象となります。
- PacBio：
- 1キットあたり2つのSMART Cell（90 Gb/Cell)からの HiFi リードが解析されます。
*HiFi 以外のCLRリードも保存してください。
特長
- LRSのためシングルセルのmRNAのアイソフォーム解析が可能
- 特別な機械は不要
- Short-Read Sequencing では解析が困難だった長距離配列の解析が可能
- 最大25µmサイズの細胞で 3,000 – 10,000個の細胞の解析が可能
プロトコール
プロトコールの概略
- サンプルを用意します。
- A. 細胞懸濁液をチップに通します。
B. ビーズをチップに通します。
C. 細胞溶解液をチップに通します。
D ビーズに結合したmRNAを回収します。 - 逆転写反応とcDNAの増幅を行い、各社キットでライブラリー調製を行います。
- ONTもしくはPacBioシーケンサーででシーケンスします。
- バーコードの解析を行います。
- バイオインフォマティクス解析を行います。
マイクロ流体チップ
本キットはマイクロ流体チップを使用します。
キット以外で必要なもの
- 核酸低吸着性1.5mLチューブ
- 15mLコニカルチューブ
- 0.2mL 8連PCRチューブ
- RNase/DNase-free フィルターチップ
- RNase/DNase-free P200フィルターチップ
その他必要な試薬などは下記プロトコールをご参照ください。
各種操作時間の目安
解析可能な細胞数
1枚のチップで3,000 ～ 10,000個の細胞を処理することができます。それ以上の細胞を処理する場合は2つのチップをご使用ください(プール可能です)。チップに投与する細胞は100µLのPBS中に15,000 ～ 35,000個になるように調製します。
| Targeted number of cells captured | Recommended cell amount in 100 ul suspension |
|---|---|
| 3,000-5,000 | 15,000-20,000 |
| 5,000-7,000 | 20,000-25,000 |
| 7,000-9,000 | 25,000-30,000 |
| 9,000-10,000 | 30,000-35,000 |
データ解析の流れ
①データのアップロード
データをデータ転送サービスやストレージサービスなどにアップロードすることでArgenTag社に共有します。
サービス例）Globus, Amazon Web Services(AWS), Google Cloud Services(GCS) など
②ArgenTag社でのデータ解析
バーコードの解析はArgenTag社独自のソフトウェアである「Taggy」を使用し、通常１日で完了します。
バーコード解析と並行して、Flames, Seurat, Sqanti3 の分析結果を含んだ基本的な解析レポートが作成されます。
*アップロードしたデータは機密情報として扱われます。アップロードした方の同意が無く、別用途への利用や第三者への開示は行いません。
③データの納品
解析結果はAmazon Simple Storage Serviceを通じてお渡しします。
Seurat、UMAP、Squantyなどの解析結果を納品します。
【お問い合わせ先】
データに関してご不明な点がありましたら下記ご連絡先までお問い合わせください。
*英語でのお問い合わせとなります。
welcome@argentag.com
データ例
ヒト由来PBMCの解析
本キットを使用してPBMCから抽出したRNAからcDNAを合成し、ONT シーケンサーでシーケンスを行った。
シーケンス配列から解析を行い、UMAPプロットを作製した。
| Sample Prep. | |
|---|---|
| EasySep™ Direct Human PBMC Isolation Kit |
PBMC sample prep from donor - same day, ~ 270 cells/uL |
| ArgenTag beads Diversity | ~ 1M from 3 x 24 nt BC, 12 nt UMI |
| Sequencing Library | ONT SQK-LSK 114 kit |
| Sequencing & Processing | |
| Sequencing Device | ONT P2 Solo PromethION R10 x3 , 247M reads |
| Basecalling Mode | Dorado 7.4.13 - SUP V5 |
| Cell barcode demuxer | ArgenTag Taggy |
| Sequencing Metrics | |
| Estimated Number of Cells | 7,302 total |
| Reads per Cell (mean) | 14,441 |
| Sequencing Saturation | 46,2 % |
| Read Length (bp) | 774 [588 - 1,083] |
| Single-Cell Metrics | |
| Total Genes Detected | 20,724 |
| # Genes/Cell (median) | 1,032 |
| # UMIs/Cell (median) | 5,274 |
High capture efficiencyUMAP plot for human PBMC cell clusters. The gentle single-cell
partitioning retains several cellular types.
＜結果＞
各種細胞種を識別することができた。
アイソフォーム解析
PBMCに含まれている特定のmRNAの各種アイソフォームの長さについて解析を行った。
Isoform Distribution Across Structual Categories
Transcript Lengths by Structural Classification
＜結果＞
各種アイソフォームのmRNAを検出することができた。
FSM・・・リファレンス配列と完全一致のアイソフォーム
ISM・・・ リファレンス配列の外側のエクソンの数が少ないが、その他のエクソンがリファレンス配列と1部分が一致しているアイソフォーム
NIC・・・ ISMに当てはまらずリファレンス配列と同じエクソンの組み合わせを持つアイソフォーム
NNIC・・・リファレンス配列にないエクソンを少なくとも1つ含むアイソフォーム
マウス由来細胞 と ヒト由来細胞 の識別
マウス由来細胞(NIH-3T3) と ヒト由来細胞(HEK-293) を混合させたサンプルを本キットを用いてシングルセル解析を行った。
| Sample Prep. | |
|---|---|
| Cell Types | HEK-293 (Human):NIH-3T3 (Mouse) 1:1 mix, ~ 150 cells/uL in PBS |
| ArgenTag beads Diversity | ~ 1M from 3 x 24 nt BC, 12 nt UMI |
| Sequencing Library | ONT SQK-LSK 114 kit |
| Sequencing & Processing | |
| Sequencing Device | ONT P2 Solo PromethION R10, 52M reads |
| Basecalling Mode | Dorado 7.4.13 - HAC V5 |
| Cell barcode demuxer | ArgenTag Taggy |
| Sequencing Metrics | |
| Estimated Number of Cells | 7,108 total 3,436 human (48,34%), 3,534 mouse (49,72%), 138 mixed (1,94%). |
| Reads per Cell (mean) | 2,252 |
| Sequencing Saturation | 2.12% |
| Read Length (bp) | 789 [565 - 1,175] |
| Single-Cell Metrics | |
| Total Genes Detected | 31,395 |
| # Genes/Cell (median) | 1,090 |
| # UMIs/Cell (median) | 1,852 |
Single-cell resolusionBanyard of a 1:1 human and mouse cell mix, shows good
resolution of cell types with < 2% multiplet rate.
＜結果＞
マウス由来細胞 と ヒト由来細胞 を高い解像度で識別することができた。
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Single-Cell RNA Library Kit for LRS
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- 掲載されている製品について
- 【試薬】
- 試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
- 試験研究用以外にご使用された場合、いかなる保証も致しかねます。試験研究用以外の用途や原料にご使用希望の場合、弊社営業部門にお問合せください。
- 【医薬品原料】
- 製造専用医薬品及び医薬品添加物などを医薬品等の製造原料として製造業者向けに販売しています。製造専用医薬品(製品名に製造専用の表示があるもの)のご購入には、確認書が必要です。
- 表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
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