T7 RNA ポリメラーゼなど核酸関連酵素の精製に
JNC セルファイン™ フォスフェイト
セルファイン™ フォスフェイトはDNA結合タンパク質やRNA結合タンパク質などの核酸結合タンパク質に親和性を持つ樹脂で、セルロース粒子にリン酸エステル基が修飾されています。mRNAワクチンの製造過程に使用されるT7 RNAポリメラーゼなどの核酸関連酵素を効率よく精製することができます。
| セルファイン™ フォスフェイト | |
|---|---|
| マトリックス | セルロース粒子 |
| 平均粒子径 | 90μｍ |
| リガンド | リン酸エステル基 |
| イオン交換容量 | 0.3 - 0.8 meq/mL |
| 吸着量 | ≧ 20 mg/mL (リゾチーム) |
| pH 安定性 | 5 - 12 |
| 操作圧力 | < 0.2 MPa |
| 保存液 | 20%エタノール水溶液 |
セルファイン™ フォスフェイトの化学構造
T7 RNAポリメラーゼ精製例
T7 RNAポリメラーゼを発現した大腸菌（pAR1219）の培養液を硫安沈殿後、セルファイン™MAX DEAE(弱アニオン)、セルファイン™ フォスフェイトおよびセルファイン™ ET クリーンLで高純度に精製した事例を紹介します。
M: 分子量マーカー
1: 大腸菌ライセート
2: 硫安沈殿後
3: セルファイン™ MAX DEAE 精製後
4: セルファイン™ フォスフェイト 精製後
5: 市販T7 RNAポリメラーゼ
1: 大腸菌ライセート
2: 硫安沈殿後
3: セルファイン™ MAX DEAE 精製後
4: セルファイン™ フォスフェイト 精製後
5: 市販T7 RNAポリメラーゼ
精製プロセスの各ステップでサンプリングし、SDS-PAGEで分析した。工程を経るごとに夾雑タンパク質が減少している様子が分かり、セルファイン™ フォスフェイト精製後はシングルバンドが得られた。
セルファイン™ MAX DEAE による粗精製
セルファイン™ フォスフェイトによる精製
セルファイン™ ETクリーンL による
エンドトキシンの除去検討
| フラクション | 酵素活性(Unit/protein) | 酵素活性回収率 (%) |
タンパク質回収率 (%) |
|---|---|---|---|
| サンプル | 94043 | 100 | 100 |
| フロースルー | 2763 | 1.8 | 59.8 |
| 溶出画分 | 267034 | 70.2 | 24.7 |
セルファイン™ フォスフェイト工程 各分画における T7 RNAポリメラーゼ の回収率
溶出画分中のT7 RNAポリメラーゼ活性回収率は70.2%と高い値を示した。タンパク質量は24.7%に減少しており、フロースルーで夾雑タンパク質が効率よく除去されていることがわかる。
セルファイン™ フォスフェイトの細孔特性
定置洗浄（ＣＩＰ）安定性
セルファイン™ フォスフェイトは0.2M NaOH水溶液に安定で繰り返し使用が可能です。
タンパク質の分離特性
セルファイン™ フォスフェイトは塩濃度を変化させることでタンパク質の分離が可能です。陽イオン交換体のような挙動を示しますが、一般的な陽イオン交換体よりも高塩濃度で溶出する傾向があります。
| カラム | ： | ID 1.1 cm – H 10 cm |
| 流速 | ： | 2 ml/min (126cm/h) |
| 平衡化バッファー | ： | 0.01M acetate buffer, pH4.8 |
| 溶出バッファー | ： | 0 → 1 mol/L NaCl グラジエント |
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