同仁化学　微生物増殖アッセイキット

• 寒天培地法や微量液体希釈法に比べ短時間での検出が可能である。
• マイクロプレートを使った多検体処理が可能である。
• 培地成分による影響を受けにくい製品である。

※使用方法は、プロトコルをご覧ください。

キット以外に必要な物

• マイクロピペット(10 μL, 200 μL)およびマルチチャンネルピペット(200 μL)
• インキュベーター
• プレートリーダー(450～490 nmの吸光フィルター)
• 96穴マイクロプレート
• 1.5 mLチューブ

操作は試薬の添加だけ！！

測定の際は、96ウェルマイクロプレートに微生物懸濁液を準備し、試薬を添加後、インキュベーションするだけで微生物の代謝活性に応じた色素の発色が見られます。インキュベーション後は、プレートリーダーにて吸光度(450 nm)を測定し、結果の解析を行います。

各種微生物における検出感度

1. 培養した各微生物を標準液体培地(pH 7.0)で希釈した。
2. 1ウェル(96ウェル-plate)あたり190 μLの微生物希釈液を添加した。
3. 各ウェルに発色試薬10 μLを添加し、30℃または37℃でインキュベートした。
4. 1時間後及び4時間後の吸光度(460 nm：λ_max WST-8 formazan)を測定した。

※微生物希釈液は標準寒天培地でも培養を行い、得られたコロニー数より細胞密度を決定した。

• 	微生物種	インキュベート時間
  		1h	4h
  Yeast	Candida utilis Saccharomyces cerevisiae Zygosaccharomyces rouxii	5.53 x 107 8.70 x 105 1.65 x 105	6.18 x 106 2.65 x 105 2.47 x 104
  Gram-positive bacteria	Bacillus cereus Bacillus subtillis Corynebacterium glutamicum Enterococcus faecalis Lactobacil/us case, Listeria monocytogenes Micrococcus luteus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis	6.70 x 105 2.45 x 106 1.69 x 106 5.18 x 107 8.40 x 107 5.07 x 106 8.29 x 105 2.78 x 106 5.53 x 106	6.77 x 104 6.71 x 105 2.47 x 105 1.76 x 106 2.34 x 106 6.46 x 105 1.29 x 105 2.71 x 105 1.12 x 106

• 	微生物種	インキュベート時間
  		1h	4h
  Gram-negative bacteria	Acetobacter Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabi/is Pseudomonas aeruginosa Salmonella enteritidis Salmonella typhimurium Serratia marcesens Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica	2.53 x 107 1.31 x 107 1.76 x 107 7.42 x 106 1.76 x 108 2.55 x 107 1.73 x 107 7.15 x 107 2.90 x 107 1.92 x 107	7.39 x 106 2.86 x 106 5.59 x 105 1.35 x 106 1.78 x 107 1.06 x 106 2.60 x 106 5.08 x 106 1.03 x 107 5.46 x 106

表に示された細胞密度(CFU/mL)は、発色試薬添加後１時間または4時間後インキュベートし、得られた吸光度(460 nm)が0.5以上であった各微生物の細胞密度(CFU/mL)

細菌を抗生物質を含むMueller-Hinton培地中で6時間(35℃)インキュベートした後、発色試薬を添加し2時間(35℃)反応させた。
各薬剤濃度において、発色が確認されなかった濃度を同キットにおけるMinimum inhibitory Concentration(MIC)とした。
Microdilution method(日本化学療法学会標準法)では22時間のインキュベーション後に目視でMICを求めるが、本製品を用いた場合、8時間でMicrodilution methodと同等のMIC(μg/mL)を得ることができた。

E.coli懸濁培地を10倍希釈系列で96 ウェルマイクロプレートに播種した。
発色試薬を添加し、37℃でインキュベートしながら一定時間ごとの吸光度(460 nm)を測定した。
各菌体密度においてOD₄₆₀が0.5に達した時間を求めると、菌体密度とOD₄₆₀=0.5到達時間との間に高い直線関係が得られた。