同仁化学 微生物増殖アッセイキット

微生物はエネルギー代謝活動により細胞内にNAD(P)Hを生成しますが、本キットの色素WST-8は電子メディエーターを介することで、このNAD(P)Hにより還元され水溶性の色素が生成されます。この色素生成量は、微生物のエネルギー代謝に比例するため、オレンジ色の呈色を確認することで、その微生物の生存率や活性度合を確認することができます。
また、従来の平板培養法に比べ、液体培地で培養した微生物を使用できるため、評価にかかる時間を大幅に短縮することができます。

※本製品は、福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発製品です。

特長

  • 寒天培地法や微量液体希釈法に比べ短時間での検出が可能である。
  • マイクロプレートを使った多検体処理が可能である。
  • 培地成分による影響を受けにくい製品である。

※使用方法は、プロトコルをご覧ください。

キット構成

100 tests 500 tests
・WST Solution
・Electron Mediator Reagent(DMSO Solution)
:1 mL x 1
:0.1 mL x 1
・WST Solution
・Electron Mediator Reagent(DMSO Solution)
:1 mL x 5
:0.5 mL x 1
キット以外に必要な物
  • マイクロピペット(10 μL, 200 μL)およびマルチチャンネルピペット(200 μL)
  • インキュベーター
  • プレートリーダー(450~490 nmの吸光フィルター)
  • 96穴マイクロプレート
  • 1.5 mLチューブ

操作方法

操作は試薬の添加だけ!!

測定の際は、96ウェルマイクロプレートに微生物懸濁液を準備し、試薬を添加後、インキュベーションするだけで微生物の代謝活性に応じた色素の発色が見られます。インキュベーション後は、プレートリーダーにて吸光度(450 nm)を測定し、結果の解析を行います。

検出感度

各種微生物における検出感度

  1. 培養した各微生物を標準液体培地(pH 7.0)で希釈した。
  2. 1ウェル(96ウェル-plate)あたり190 μLの微生物希釈液を添加した。
  3. 各ウェルに発色試薬10 μLを添加し、30℃または37℃でインキュベートした。
  4. 1時間後及び4時間後の吸光度(460 nm:λmax WST-8 formazan)を測定した。

※微生物希釈液は標準寒天培地でも培養を行い、得られたコロニー数より細胞密度を決定した。

  • 微生物種 インキュベート時間
    1h 4h
    Yeast Candida utilis
    Saccharomyces cerevisiae
    Zygosaccharomyces rouxii
    5.53 x 107
    8.70 x 105
    1.65 x 105
    6.18 x 106
    2.65 x 105
    2.47 x 104
    Gram-positive
    bacteria
    Bacillus cereus
    Bacillus subtillis
    Corynebacterium glutamicum
    Enterococcus faecalis
    Lactobacil/us case,
    Listeria monocytogenes
    Micrococcus luteus
    Staphylococcus aureus
    Staphylococcus epidermidis
    6.70 x 105
    2.45 x 106
    1.69 x 106
    5.18 x 107
    8.40 x 107
    5.07 x 106
    8.29 x 105
    2.78 x 106
    5.53 x 106
    6.77 x 104
    6.71 x 105
    2.47 x 105
    1.76 x 106
    2.34 x 106
    6.46 x 105
    1.29 x 105
    2.71 x 105
    1.12 x 106
  • 微生物種 インキュベート時間
    1h 4h
    Gram-negative
    bacteria
    Acetobacter
    Escherichia coli
    Klebsiella pneumoniae
    Proteus mirabi/is
    Pseudomonas aeruginosa
    Salmonella enteritidis
    Salmonella typhimurium
    Serratia marcesens
    Vibrio parahaemolyticus
    Yersinia enterocolitica
    2.53 x 107
    1.31 x 107
    1.76 x 107
    7.42 x 106
    1.76 x 108
    2.55 x 107
    1.73 x 107
    7.15 x 107
    2.90 x 107
    1.92 x 107
    7.39 x 106
    2.86 x 106
    5.59 x 105
    1.35 x 106
    1.78 x 107
    1.06 x 106
    2.60 x 106
    5.08 x 106
    1.03 x 107
    5.46 x 106

表に示された細胞密度(CFU/mL)は、発色試薬添加後1時間または4時間後インキュベートし、得られた吸光度(460 nm)が0.5以上であった各微生物の細胞密度(CFU/mL)

アプリケーション

増殖アッセイ
生存への影響を比較
薬剤感受性試験

黄色ブドウ球菌(SA) およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA) を96 ウェルプレートに播種後、各濃度に調整した抗生物質を添加した。6 時間37℃でインキュベート後、試薬を添加し更に2時間発色反応を行った。結果、生存細胞が存在するウェルのみ発色がみられ、目視にて容易に抗生物質の抗菌効果を確認できた。

薬剤感受性試験への応用

細菌を抗生物質を含むMueller-Hinton培地中で6時間(35℃)インキュベートした後、発色試薬を添加し2時間(35℃)反応させた。
各薬剤濃度において、発色が確認されなかった濃度を同キットにおけるMinimum inhibitory Concentration(MIC)とした。
Microdilution method(日本化学療法学会標準法)では22時間のインキュベーション後に目視でMICを求めるが、本製品を用いた場合、8時間でMicrodilution methodと同等のMIC(μg/mL)を得ることができた。

抗生物質 Escherichina coli Staphylococcus aureus subsp. aureus
本製品 Microdilution method 本製品 Microdilution method
Ampicillin 2 2-4 0.125 0.125-0.25
Cefotaximine 0.062-0.125 0.031-0.125 4 4
Chloramphenicol 8 16 8 8
Gentamicin 0.5-1 1 0.031 0.031-0.062
Ciprofloxacin 0.062 0.031-0.062 1 0.25

微生物増殖試験

E.coli懸濁培地を10倍希釈系列で96 ウェルマイクロプレートに播種した。
発色試薬を添加し、37℃でインキュベートしながら一定時間ごとの吸光度(460 nm)を測定した。
各菌体密度においてOD460が0.5に達した時間を求めると、菌体密度とOD460=0.5到達時間との間に高い直線関係が得られた。

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