ゲルクロマトでのりん酸化タンパク質精製に

Phos-tag® Agarose

Phos-tag®Agaroseをカラムに充てんし、混合物からりん酸化タンパク質を分離、精製、濃縮します。界面活性剤、還元剤を使用しないため、生体内に近い状態のりん酸化タンパク質が得られます。

特長

  • 1時間以内にりん酸化タンパク質が精製可能
  • 全ての実験操作を生理条件下(pH7.5)で実施可能
  • 還元剤や界面活性剤は不要
  • 実験操作は通常のアフィニティークロマトグラフィーとほぼ同様

りん酸アフィニティークロマトグラフィー法の原理

使用例:A431ライセート中りん酸化タンパク質の精製

M:分子量マーカー
Lane1:未吸着画分
Lane2:吸着画分
Lane3:カラム洗浄画分

Phos-tag®Agaroseをカラムに充填し、その上にA431のライセートをアプライ。
それぞれをSYPRO Ruby染色 (左図)とAnti-pTyr抗体を用いたウエスタンブロット (右図)にて検出した。

その結果、カラム吸着画分にりん酸化タンパク質が濃縮されていることが確認できた。

参考文献
  1. "Novel immobilized zinc(II) affinity chromatography for phosphopeptides and phosphorylated proteins", E. Kinoshita, A. Yamada, H. Takeda, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, J. Sep. Sci., 2005, 28, 155-162.
  2. "Enrichment of phosphorylated proteins from cell lysate using a novel phosphate-affinity chromatography at physiological pH", E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, A. Yamada, M. Endo, and T. Koike, Proteomics, 2006, 6, 5088-5095.
  3. "りん酸基親和性クロマトグラフィーを用いた細胞内のりん酸化タンパク質の網羅的精製", 木下英司, 木下恵美子, 小池透, バイオテクノロジージャーナル, 2007, 7, 217-220.
  4. "Phos-tag beads as an immunoblotting enhancer for selective detection of phosphoproteins in cell lysates", E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike, Analytical Biochemistry, 2009, 389, 83-85.
  5. "細胞内りん酸化タンパク質を高精度に検出するためのPhos-tagビーズによるサンプル前処理法", 木下英司, 木下恵美子, 小池透, 2009, 9, 934-938.

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