StemSure^® 凍結保存溶液

• ヒトiPS細胞･マウスES細胞を未分化能を維持したまま凍結保存できる。
• -80℃で長期間凍結保存できる。
• 汎用動物細胞株の凍結保存後の細胞生存率が良い。
• 血清を含まない無血清タイプ。
• 面倒な試薬の調製が不要。
• プログラムフリーザーも不要。

• 細胞生存率試験 (マウスES細胞D3株を使用)
• 無菌試験
• エンドトキシン
• マイコプラズマ試験

ヒトiPS細胞の凍結保存

1. 凍結保存

1. ヒトiPS細胞を培養中のディッシュより培養液を除去し、PBSで洗浄後、Accutaseなどで細胞を剥がす。
2. 10 μmol/L Y-27632を含むヒトiPS細胞用培地 (hPSC培地 (+ROCKi) ) を加え、ピペッティングでシングルセルに分散する。
3. 分散した細胞懸濁液をチューブに移し、遠心 (1,000rpm, 3分, 室温) 後、上清を除去する。
4. hPSC培地 (+ROCKi) を含む培地を加え、ピペッティングで懸濁する。
5. 細胞数をカウントする。
6. 1 x 10⁶ cells/バイアルとなるよう細胞懸濁液を保存用バイアルに分注する。
7. 遠心 (1,000rpm, 3分, 室温) 後、上清を除去する。
8. 本製品 500 μL/バイアルで懸濁し、-80℃で凍結する。

2. 融解

1. 凍結していたバイアルにhPSC培地 (+ROCKi) を加え、凍結細胞を融解する (温浴は使用しない)。
2. 遠心 (1,000rpm, 3分, 室温) 後、上清を除去し、再度hPSC培地 (+ROCKi) を加え、懸濁する。
3. 細胞数をカウントする。
4. 2 x 10⁵ cells/6cm dishで播種する 。

マウスES細胞・汎用動物細胞株の凍結保存

1. 凍結保存

1. 細胞をチューブに収集する。
2. 遠心し、上清を除去する。
3. チューブに本製品を添加し、懸濁する。
4. 懸濁液を保存用チューブに分注する。
5. 保存用チューブを-80℃で一晩凍結させる。
6. -150℃、あるいは-80℃で保存する。

2. 融解

1. 凍結保存しておいたチューブを37℃の温浴槽で融解させる。
2. 培養に使用する培養用培地に懸濁する。
3. 遠心し、上清を除去後、培養用培地で懸濁する。
4. 培養容器に播種する。

ヒトiPS細胞201B7株をシングルセルに分散したあと、StemSure^®凍結保存溶液に懸濁して、-80℃で4日間凍結保存した。凍結融解を3回繰り返した後、細胞生存率および各種未分化マーカー (Oct3/4, Sox2, SSEA-4, Tra-1-81) の発現を確認した。

細胞生存率

未分化マーカー発現の確認

StemSure^®凍結保存溶液を用いて、マウスES細胞D3株を凍結保存した。凍結した細胞を融解し、細胞生存率を測定した。また、融解した細胞を10日間培養し、コロニー形成率を測定した。

-150℃保存 (30ヶ月)	<凍結保存> 　① 1～2 x 106cellsを本製品1 mLに懸濁し、 　 　保存用チューブに分注する。 　② -80℃で1日間凍結保存後、-150℃に移し、 　　 凍結保存する。あるいは-80℃で凍結保存する。 <融解> 　③ 37℃の温浴層で融解する。 　④ 培養用培地で懸濁し、遠心する。 　⑤ 上清を吸引し、培養用培地で懸濁する。 ○コロニー形成の確認 　≪播種細胞数≫ 　　　500 cells/well 　　　(コラーゲンコート６穴プレート) 　≪培養期間≫ 　　　10日間
-80℃保存 (24ヶ月)

細胞形態・未分化マーカーの確認

StemSure^®凍結保存溶液を用いてマウスES細胞D3株の凍結融解を4回繰り返した後、細胞形態、ALP染色、各種未分化マーカー (Oct3/4, Sox2, Nanog, SSEA-1) の発現を確認した。

<凍結保存>
　① 1～2 x 10⁶cellsを本製品 1 mLに懸濁し、保存チューブに分注する。
　② -80℃で1日間凍結保存後、-150℃に移し、1日間保存する。

<解凍>
　③ 37℃の温浴槽で融解後、培養用培地で懸濁し、遠心後、上清を除去する。
　④ 培養用培地で再懸濁後、培養容器に播種し、培養する。
　⑤ ①～④を4回繰り返す。
　その後、位相差顕微鏡 (Phase) で撮影、ALP染色、
　免疫染色 (各種未分化マーカー、DAPI) を行った。

テラトーマ形成の確認

StemSure^®凍結保存溶液を用いてマウスES細胞D3株を-150℃で11ヶ月間凍結保存した。その細胞を融解後、培養し、免疫不全マウスの皮下にインジェクションした。皮下にテラトーマが形成され、その内部に神経組織 (外胚葉由来)、軟骨組織 (中胚葉由来)、繊毛上皮を伴う管腔構造 (内胚葉由来) などを確認した。

StemSure^®凍結保存溶液を用いて、各種動物細胞株を凍結保存した。30ヶ月後も高い生存率を維持していること、融解した細胞が生着することを確認した。

<凍結保存> 　① 1～2 x 106cellsを本製品1 mLに懸濁し、保存チューブに分注する。 　② -80℃で1日間凍結保存後、-150℃に移し、2ヶ月、4ヶ月、 　　30ヶ月間凍結保存する。 <融解> 　③ 37℃の温浴層で融解後、培養用培地で懸濁し、遠心する。 　④ 上清を除去し、培養用培地で懸濁する。

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