SuperSep™ Phos-tag^™ 프리캐스트 겔

알부민 탈인산화

β-카제인의 시간 의존적 인산 제거

[Electrophoresis Buffer] Tris-Glycine SDS buffer
[Electrophoresis Samples]
　Lane1: β-casein (AP-treatment: 0 min)
　Lane2: β-casein (AP-treatment: 15 min)
　Lane3: β-casein (AP-treatment: 30 min)
　Lane4: β-casein (AP-treatment: 45 min)
　Lane5: β-casein (AP-treatment: 60 min)
[Electrophoresis Conditions] 35mA, 60min
[Staining] Quick CBB staining
[Destaining] Deionized Water

시간에 따른 인산화 수준의 변화

절차

인간 폐암 세포주 Lu99에 X선 조사(5 Gy)를 실시하고, 여러 시점에서 세포를 채취했다. 세포 추출물을 조제한 후, 50 μmol/L 농도의 10% SuperSep™ Phos-tag™

를 사용하여 13개의 웰에서 SDS-PAGE를 수행했다.

10 mmol/L EDTA를 함유한 전사 완충액에서 젤을 부드럽게 교반한 후, 단백질을 PVDF 막으로 전사했다. 막을 2% 우유/TBS-T로 차단 처리한 뒤, 1차 항체(상단 이미지: p53, 하단 이미지: 세포주기 단백질)와 반응시켰다. 검출은 화학발광법을 통해 수행되었다.

결과

p53 단백질의 축적량은 X선 조사 4시간 후에 가장 높은 수준을 보였다. X선 조사 후 단백질 X의 인산화 수준은 시간이 지남에 따라 변화했다.

대조군 단백질의 전기영동

전기영동 조건

30 mA/gel (constant), 60 mins

예시

소 우유 유래 α-카제인, 탈인산화 처리된 것 (5 μg/레인, 품번 038-23221)

• 이 제품에는 인산화가 제거되지 않은 α-카제인이 포함되어 있습니다. 기존의 SDS-PAGE에서는 하나의 주요 밴드만 나타나지만, Phos-tag™ SDS-PAGE에서는 α-카제인과 인산화가 제거된 α-카제인의 두 가지 주요 밴드가 나타납니다.

러닝 버퍼

염색

Quick CBB Plus (Cat. No. 174-00553)

For Bio-Rad Mini-PROTEAN^® Tank

198-17981	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 7.5%, 17well, 83×100×3.9 mm
195-17991	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 12.5%, 17well, 83×100×3.9 mm

For Invitrogen^® XCell SureLock Mini-Cell Tank

192-18001	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 7.5%, 17well, 100×100×6.6 mm
199-18011	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 12.5%, 17well, 100×100×6.6 mm

For FUJIFILM Wako Easy Separator™

192-17401	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 6%, 13well
199-17391	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 6%, 17well
193-16711	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 10%, 13well
190-16721	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 10%, 17well
195-17371	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 7.5%, 13well
192-17381	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 7.5%, 17well
195-16391	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 12.5%, 13well
193-16571	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 12.5%, 17well
193-16691	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 15%, 13well
196-16701	SuperSep Phos-tag (50μmol/l), 15%, 17well

Q1. Phos-tagTM 프리캐스트 겔은 어떤 전기영동 탱크와 호환됩니까?

Phos-tag 프리캐스트 겔은 [83 x 100 x 3.9 mm], [100 x 100 x 3.0 mm] 및 [100 x 100 x 6.6 mm]의 세 가지 카세트 크기로 제공됩니다.

• [83 x 100 x 3.9 mm]은 Bio-Rad Mini-PROTEAN 탱크에 적합합니다.
• [100 x 100 x 3.0 mm]은 Wako Easy Separator에 적합합니다.
• [100 x 100 x 6.6 mm]은 Invitrogen^® XCell SureLock^® Mini-Cell Tank에 적합합니다.

Q2. 어떤 겔 염색 방법을 사용할 수 있나요?

CBB, 네거티브, 은염색 및 형광 염색법을 사용할 수 있습니다.

Q3. CBB로 염색된 겔을 명확하게 탈색할 수 없습니다.

탈색 시 전자레인지를 사용하면 더 선명한 겔을 얻을 수 있습니다.

절차

염색된 젤을 100mL의 탈이온수에 담근 용기에 옮기고, Kim-Wipes를 몇 장 넣은 뒤 전자레인지에서 몇 분간 가열합니다. 탈이온수를 교체하고 동일한 절차를 2~3회 반복합니다. 용기가 뜨거우므로 취급 시 주의하십시오.

Q4. 이 제품을 웨스턴 블롯에 사용할 수 있습니까?

예: 그러나 멤브레인으로의 최적의 전사 효율을 얻기 위해서는 EDTA 처리를 통해 겔 내의 아연을 제거해야 합니다.

절차

10 mmol/L EDTA가 포함된 전사 완충액(25 mmol/L 트리스, 192 mmol/L 글리신, 10% 메탄올)에 젤을 담그고 10분 동안 부드럽게 교반합니다. 이 과정을 2회 반복합니다. EDTA가 포함되지 않은 전사 완충액(25 mmol/L 트리스, 192 mmol/L 글리신, 10% 메탄올)으로 교체한 후 10분간 교반하고, PVDF 막 또는 니트로셀룰로오스 막으로 전사합니다. 전사 효율이 낮다면 EDTA 처리 횟수나 EDTA 농도를 높이는 것을 고려하십시오.

Q5. 밴드가 왜곡됩니다.

EDTA, 무기염, 계면활성제가 포함된 시료에서는 밴드의 왜곡 및 테일링 현상이 관찰될 수 있습니다. 이러한 경우, 투석 또는 TCA를 이용한 침전을 통해 시료의 염분을 제거하는 것이 효과적입니다. 빈 레인이 존재하는 경우에도 밴드 왜곡이 발생할 수 있습니다. 왜곡을 방지하려면 빈 레인에 시료 완충액(1x)을 도포하십시오.

Q6. 인산화 및 비인산화 표적 단백질이 분리되지 않습니다.

전기영동을 수행하고 β-카제인(양성 대조군) 및 알칼리성 포스파타제로 처리한 β-카제인(음성 대조군)을 사용하여 밴드 이동 여부를 확인하십시오. 밴드 이동이 관찰된다면, 대상 단백질의 인산화 및 비인산화 변이체가 Phos-tag^™ 및/또는 본 제품의 아크릴아마이드 농도로는 분리되지 않을 가능성이 높습니다.

Q7. 이 제품에 세포의 원추출물을 사용할 수 있습니까?

예: 그러나 Rf 값이 작은 단백질을 사용할 경우 밴드가 불분명해질 수 있습니다.

Q8. 웰에 도포해야 할 적절한 시료량은 얼마입니까?

CBB 염색을 한 정제 단백질의 경우 1-5 µg, 조직 또는 세포 추출물의 경우 10-30 µg입니다(단백질 발현 수준에 따라 양을 조절하십시오).

• 이는 단지 권장량일 뿐입니다. 적절한 시료량을 결정하기 위해서는 SDS-PAGE 또는 웨스턴 블롯을 수행해야 합니다.

Q9. 어떤 분자량 마커를 사용해야 합니까?

본 제품은 마커의 분자량에 영향을 받지 않으므로 특별히 권장하는 마커는 없습니다. 마커 대신 대장균 유래 재조합 단백질이나 인산화가 제거된 시료를 네거티브 대조군으로 사용하는 것이 좋습니다.

Q10. 제품에 어떤 이온 복합체가 포함되어 있습니까?

제품에는 아연 이온이 포함되어 있습니다.

Q11. 밴드 이동이 인산화에 의한 것인지 어떻게 확인할 수 있습니까?

동일한 겔 농도의 12.5% SuperSep™ Ace (Cat. No. 199-14971)를 사용하여 겔 전기영동을 수행하여 표적 단백질이 분해되지 않았음을 확인하십시오.