RNA抽出・精製試薬

RNAは遺伝情報の発現において非常に重要な役割を担っています。しかしながらRNAの安定性はDNAに比べ著しく低いため、抽出・精製の工程においてRNAを高品質で取得することがこの関連実験では重要となってきます。当社は高品質なRNAの精製が可能なRNA抽出・精製試薬を取り扱っています。

学術コンテンツ

RNA抽出・精製の基本操作と原理

RNA抽出・精製は遺伝子発現解析やcDNAクローンの作製などにおいて必須の工程です。RNAを構成するヌクレオチドのリボースは2’位にヒドロキシ基があるため、反応性が高く、DNAよりも分解されやすいので取り扱いには注意が必要です。また生体中に存在するRNA分解酵素(RNase)は、容易にRNAを分解し、熱でも失活しにくく、活性にカチオンを必要としないためキレート剤による活性の抑制も困難です。RNA抽出・精製ではいかに早くRNaseを不活化できるかが重要なポイントとなります。

以下に代表的なRNAの抽出・精製方法であるAGPC (Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)法の操作と原理を記載します。なお、AGPC法はその後改良され、現在では後述のグアニジンイソチオシアネートとフェノールを含む溶解バッファーがRNA抽出試薬として広く普及しています(ニッポンジーン ISOGENなど)。改良法は幅広いサンプルに適用でき、同一サンプルからDNAやタンパク質も回収できるという特長があります。

細胞の溶解とタンパク質の変性

DNA抽出・精製と同様、最初の工程は細胞の溶解です。変性剤であるグアニジンイソチオシアネートと界面活性剤のサルコシル、還元剤のメルカプトエタノール、クエン酸ナトリウム(pH 7.0)からなる溶解バッファー中で細胞を溶解またはホモジナイズします。既に述べたように、RNA抽出・精製ではRNaseをいかに早く不活化ができるかが重要であり、グアニジン塩の中でもタンパク質変性作用の強いグアニジンイソチオシアネートが使用されています。グアニジンイソチオシアネートはRNaseをはじめサンプル中のあらゆるタンパク質を変性させます。

夾雑物の除去

溶解バッファーを加えたサンプルにpH 4.0の酢酸ナトリウムを加えて酸性条件にし、フェノール/クロロホルムを添加して遠心分離を行うとRNAは水層、タンパク質やDNAはフェノール層に分離します。水層のみ分取することでRNAが分離できます。

洗浄と溶解・溶出

水層に存在するRNAをイソプロパノールおよびエタノールで沈殿・洗浄します。RNAを溶解する際にはRNaseフリー水もしくはDEPC(Diethylpyrocarbonate)処理水を使用します。

上記のAGPC法の他にシリカメンブレンを用いたスピンカラムでRNAを抽出・精製する方法もあります(ニッポンジーン ISOSPIN RNAシリーズ)。この方法はAGPC法よりも多検体を処理することができ、収量も高く、有機溶媒が不要といったメリットがあります。一方、RNase活性が高いサンプルや脂質の多いサンプルにはAGPC法が有効です。

参考文献

Piotr, C. and Sacchi, N.:Analytical biochemistry, 162(1), 156(1987).
平尾一郎, 胡桃坂仁志 編:「目的別で選べる核酸実験の原理とプロトコール」 (羊土社) (2011).
Green, R. M. and Sambrook, J.:”Molecular Cloning A Laboratory Manual, 4th ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012).