R&D Systems社 NK細胞増殖試薬(Cloudz Human NK Cell Expansion Kit)

本製品は、K562フィーダー細胞フリー条件下で、peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)からNK細胞を増殖させるキットです。CD2抗体、NKp46抗体が結合している溶解可能なマイクロビーズと、マイクロビーズを溶解させるバッファーがセットとなっています。マイクロビーズがすぐに溶解するため、細胞の回収が簡単です。おおよそ10 - 14日間でPBMCsからNK細胞を100倍に増殖させることができます。

特長

  • 10 - 14日間でPBMCsからNK細胞が100倍に増殖
  • CD2/NKp46抗体が結合したマイクロビーズを溶解可能
  • 磁気ビーズを不使用

キット構成

表面に抗体が結合したCloudzのイメージ

Cloudz CD2/NKp46※1・・・9 mL
Cloudz 6x Release Buffer※2・・・100 mL
*1:CD2抗体/NKp46抗体が結合したマイクロビーズ
*2:マイクロビーズを溶解させるバッファー

その他必要な試薬・機器

  • Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
  • Recombinant Human IL-2 (R&D Systems, 製造元コード:202-IL or 202-GMP)
  • Recombinant Human IL-12 (R&D Systems, 製造元コード: 219-IL)
  • Recombinant Human IL-18 (R&D Systems, 製造元コード:9124-IL)
  • Recombinant Human IL-21 (R&D Systems, 製造元コード:8879-IL)
  • 培地:ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Media, Xeno-Free (製造元コード:CCM032)
  • 1x PBS
  • Fetal Bovine Serum(必要に応じて)
  • ピペットおよびチップ
  • 15mLもしくは50mL 遠心チューブ
  • 24ウェル培養プレート
  • T-25 フラスコ
  • T-75 フラスコ
  • CO2インキュベーター
  • 顕微鏡
  • フローサイトメーター
  • セルカウンター

プロトコール例

培地:ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Media, Xeno-Freeを使ったFBSフリー条件下でのNK細胞の増殖例
*FBSを含む培地でのご使用も可能です。

FBSフリー条件でのプロセス

0日目

  1. 適量の1X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Media(インターロイキン含有)を室温に戻します。
  2. 単離したPBMCまたはCD3-depleted PBMCからフローサイトメトリー解析によって最初のNK細胞の濃度(NK cells/mL)を確認します。この時のNK細胞の濃度はPBMC濃度の5-10%が一般です。
  3. NK細胞の濃度が約0.2X106 cells/mLになるように1X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Mediaで希釈します。
  4. PBMCとNK細胞(0.2X106 cells/mL)を24ウェル培養プレートに1mLずつ播種します。
  5. Cloudz CD2/NKp46 30µLを各ウェルに加え、COインキュベーター内でインキュベートします。

2日目
各ウェルに1mLの2X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Mediaを加えインキュベートします。

4日目
1つのウェルから全量をT-25フラスコに移し替え、室温に戻した2X Complete ExCellerate™ Human NK Expansion Media 2mLをフラスコに加えインキュベートします。この操作を各ウェルで行います。

7日目
室温に戻した2X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion™ Media 4mLをそれぞれのT-25フラスコに加えインキュベートします。

9日目
T-25フラスコ内の全量をT-75フラスコに移し替え、 室温に戻した2X Complete ExCellerate™ Human NK Expansion Media 8mLを加えインキュベートします。この操作を各T-25フラスコで行います。

11日目
各T-75フラスコから培地 8mLを捨て、室温に戻した2X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Media 8mLを加えます。

14日目

  1. T-75フラスコの全量を50mLのコニカルチューブに移し替え、300 X Gで5分間遠心します。
  2. 上清を捨て、1X Release Buffer 10mLを加えた後、ピペットで懸濁します。
  3. 300 X Gで5分間遠心後、上清を捨て、1XPBSで再懸濁します。
  4. CD3とCD56の発現を確認するために染色後、フローサイトメトリー解析を行います。

データ例

FBSフリー条件でのNK細胞の増殖

  • ExCellerate™ NK Expansion Mediaの培地でPBMCからNK細胞を増殖させた。
      14日後にはNK細胞の数が0日と比べて100倍近く観察された。

  •     ExCellerate™ NK Expansion Mediaの培地で3ドナー由来のPBMCを培養した。
        グラフは生細胞における各細胞の割合の平均の結果。時間経過に伴って
        NK細胞(CD3-CD56+, CD3+CD56+)の割合が高くなっていた。

FBSを含む条件でのNK細胞の増殖

  • ■ Cloudz NK Cell Expansion Kit を用いたNK細胞の増殖と増殖後の純度

      本製品を用いて、in vitro 10日間 human PBMCsを増殖させた。
     (A)細胞培養6、7、9、10日目 の増殖率を評価。10日目の増殖NK細胞はほぼ300倍となった。
     (B)細胞集団を評価。CD3-CD56+NK細胞が全体の94.4%を占めた。

  • ■ 増殖したHuman NK細胞のフローサイトメトリー解析

      Cloudz NK Cell Expansion Kit を用いて、in vitro にて10日間PBMCを培養。
     増殖10日目にNK細胞を回収し、human NCAM-1/CD56抗体とHuman CD3抗体を用いて染色し、
     フローサイトメトリーにて解析した。
     (A) 未増殖のPBMCs細胞。(B) Cloudz NK Cell Expansion Kit を用いて、PBMCsを増殖。
     (A)と比較し、(B)においてCD3+CD56+NK細胞が増えたことが分かる。

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NK細胞増殖用 動物由来成分フリー培地

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Cloudz シリーズ

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