R&D Systems社　NK細胞増殖試薬(Cloudz Human NK Cell Expansion Kit)

• 10 - 14日間でPBMCsからNK細胞が100倍に増殖
• CD2/NKp46抗体が結合したマイクロビーズを溶解可能
• 磁気ビーズを不使用

その他必要な試薬・機器

• Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
• Recombinant Human IL-2 (R&D Systems, 製造元コード：202-IL or 202-GMP)
• Recombinant Human IL-12 (R&D Systems, 製造元コード： 219-IL)
• Recombinant Human IL-18 (R&D Systems, 製造元コード：9124-IL)
• Recombinant Human IL-21 (R&D Systems, 製造元コード：8879-IL)
• 培地：ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Media, Xeno-Free (製造元コード：CCM032)
• 1x PBS
• Fetal Bovine Serum（必要に応じて）
• ピペットおよびチップ
• 15mLもしくは50mL 遠心チューブ
• 24ウェル培養プレート
• T-25 フラスコ
• T-75 フラスコ
• CO２インキュベーター
• 顕微鏡
• フローサイトメーター
• セルカウンター

培地：ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Media, Xeno-Freeを使ったFBSフリー条件下でのNK細胞の増殖例
＊FBSを含む培地でのご使用も可能です。

0日目

1. 適量の1X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Media(インターロイキン含有)を室温に戻します。
2. 単離したPBMCまたはCD3-depleted PBMCからフローサイトメトリー解析によって最初のNK細胞の濃度(NK cells/mL)を確認します。この時のNK細胞の濃度はPBMC濃度の5-10%が一般です。
3. NK細胞の濃度が約0.2X10⁶　cells/mLになるように1X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Mediaで希釈します。
4. PBMCとNK細胞(0.2X10⁶ cells/mL)を24ウェル培養プレートに1mLずつ播種します。
5. Cloudz CD2/NKp46 30µLを各ウェルに加え、CO_２インキュベーター内でインキュベートします。

2日目
各ウェルに1mLの2X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Mediaを加えインキュベートします。

4日目
1つのウェルから全量をT-25フラスコに移し替え、室温に戻した2X Complete ExCellerate™ Human NK Expansion Media 2mLをフラスコに加えインキュベートします。この操作を各ウェルで行います。

7日目
室温に戻した2X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion™ Media 4mLをそれぞれのT-25フラスコに加えインキュベートします。

9日目
T-25フラスコ内の全量をT-75フラスコに移し替え、 室温に戻した2X Complete ExCellerate™ Human NK Expansion Media 8mLを加えインキュベートします。この操作を各T-25フラスコで行います。

11日目
各T-75フラスコから培地 8mLを捨て、室温に戻した2X Complete ExCellerate™ Human NK Cell Expansion Media 8mLを加えます。

14日目

1. T-75フラスコの全量を50mLのコニカルチューブに移し替え、300 X Gで5分間遠心します。
2. 上清を捨て、1X Release Buffer 10mLを加えた後、ピペットで懸濁します。
3. 300 X Gで5分間遠心後、上清を捨て、1XPBSで再懸濁します。
4. CD3とCD56の発現を確認するために染色後、フローサイトメトリー解析を行います。

FBSフリー条件でのNK細胞の増殖

• 

    ExCellerate™ NK Expansion Mediaの培地でPBMCからNK細胞を増殖させた。
    14日後にはNK細胞の数が0日と比べて100倍近く観察された。

• 

      ExCellerate™ NK Expansion Mediaの培地で3ドナー由来のPBMCを培養した。
      グラフは生細胞における各細胞の割合の平均の結果。時間経過に伴って
      NK細胞(CD3^-CD56⁺, CD3⁺CD56⁺)の割合が高くなっていた。

FBSを含む条件でのNK細胞の増殖

• ■ Cloudz NK Cell Expansion Kit を用いたNK細胞の増殖と増殖後の純度

  

    本製品を用いて、in vitro 10日間 human PBMCsを増殖させた。
   (A)細胞培養6、7、9、10日目 の増殖率を評価。10日目の増殖NK細胞はほぼ300倍となった。
   (B)細胞集団を評価。CD3^-CD56⁺NK細胞が全体の94.4%を占めた。

• ■ 増殖したHuman NK細胞のフローサイトメトリー解析

  

    Cloudz NK Cell Expansion Kit を用いて、in vitro にて10日間PBMCを培養。
   増殖10日目にNK細胞を回収し、human NCAM-1/CD56抗体とHuman CD3抗体を用いて染色し、
   フローサイトメトリーにて解析した。
   (A) 未増殖のPBMCs細胞。(B) Cloudz NK Cell Expansion Kit を用いて、PBMCsを増殖。
   (A)と比較し、(B)においてCD3⁺CD56⁺NK細胞が増えたことが分かる。