食品粗抽出DNA溶液に対応した蛍光標識プローブ検出系リアルタイムPCR用試薬

ニッポンジーン DirectAce qPCR Mix plus ROX Tube

DirectAce qPCR Mix plus ROX Tubeは、食品等の粗抽出DNA溶液を鋳型DNA溶液とすることができ、リアルタイムPCR用サーマルサイクラー(プレートタイプ)に対応した蛍光標識プローブ検出系のリアルタイムPCR用マスターミックス(2 x 濃度)です。 試薬が小分け分注されており、操作性に優れています。ROXによる補正を必要とする装置にも対応するように50x ROX Passive Referenceが添付されています。

本製品は、株式会社島津製作所のAmpdirect®をベースに、専用のホットスタートPCR酵素を組合せて最適化したもので、 PCR阻害物質の影響を抑制することにより、様々な生体試料からDNAを精製することなく蛍光標識プローブアッセイを行うことができます。

DirectAce qPCR Mix plus ROX Tube は、消費者庁「別添 安全性審査済みの遺伝子組換え食品の検査方法」において、トウモロコシ穀粒の粒単位検査法及びグループ検査法に収載されました。(2017年6月現在)

本製品は、農林水産省委託事業「新農業展開ゲノムプロジェクト」(GMO評価・管理)GAM-211のもと、国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所、株式会社島津製作所、株式会社ニッポンジーンが開発を行いました。

特長

  • 粗抽出DNA溶液を鋳型として、ダイレクトにリアルタイムPCRが可能
  • PCR阻害物質であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)が反応液中に存在(0.1%)しても増幅可能
  • ROX Passive Referenceが別添付されており、様々な装置に対応可能
  • プレミックスタイプの試薬が小分け分注済みで操作が簡便

注意

  • 本製品は、蛍光標識プローブとしてMGB(Minor Groove Binder)構造を有するTaqMan®*MGBプローブのご使用には適しておりません。*TaqMan®は、Roche Molecular Systems 社の商標です。
  • 本製品は、リアルタイムPCR用サーマルサイクラーでのランモード「Fast」の標準プロトコル[95°C 20秒→'95°C 3秒→60°C 30秒) x サイクル]には対応しておりません。
  • 本製品には、dUTPは含まれていないため、Uracil-N-Glycosylaseによるキャリーオーバー処理はできません。

使用実績

本製品を利用し、下記食品の18S rRNA遺伝子及びIPCを標的とするリアルタイムPCRの増幅を確認しています。
(データご提供 : 国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所 真野 潤一博士)

使用実績

穀物・種子

トウモロコシ種子、ダイズ種子、コメ(玄米)、ワタ種子、アルファルファ種子、ベントグラス種子、フラックス種子、テンサイ種子、メロン種子、カボチャ種子

果物

キウイ果肉、パパイヤ果肉、イチゴ果肉、バナナ果肉、メロン果肉、ブドウ果実(いずれも可食部、皮は除く)

野菜

ホウレンソウ、トマト、ナス、カボチャ、ニンジン、ブロッコリー、ジャガイモ、サツマイモ、ナガイモ、シイタケ、ダイコン、ネギ(いずれも可食部、皮は除かず全体)

加工食品

小麦粉、そば粉、上新粉、ポテトチップス、チョコレート、バタークッキー、食パン、ヨーグルト、牛乳、魚肉ソーセージ、ウインナ、カマボコ、豆腐

魚介類

マグロ切り身、シャケ切り身、アジ切り身、タイ切り身、サバ切り身、エビ、イカ、アサリ

肉類

牛肉、ブタ肉

参考文献

Mano, J.; Hatano, S.; Futo, S.; Minegishi, Y.; Ninomiya, K.; Nakamura, K.; Kondo, K.; Teshima, R.; Takabatake, R.; Kitta, K.; Development of direct real-time PCR system applicable to a wide range of foods and agricultural products., Food Hyg. Saf. Sci. 2014, 55, 25-33.

実験例

前処理 - 粗抽出DNA溶液の準備

生体試料約5 gに20 mLの組織溶解液 [20mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM EDTA, 400mM NaCl, 0.3% SDS] を加えてフードミル等で破砕する。20分間常温で静置後、上清を蒸留水で2倍以上に希釈して鋳型DNA溶液とする。

PCR条件

反応液組成

2X DirectAce qPCR Mix No ROX 25 µL 12.5 µL (final conc. 1X)
25 µM Forward Primer 1 µL 0.5 µL
25 µM Reverse Primer 1 µL 0.5 µL
10 µM TaqMan® Probe 1 µL 0.5 µL
Template DNA 5 µL 2.5 µL
50X ROX Passive Reference (final conc.)*3
d.d. H2O up to 50 µL up to 25 µL

PCR条件

95 ℃ 10分 酵素活性化ステップ
95 ℃ 15秒 45サイクル Primer及びProbeのデザインや鋳型DNA等により反応の至適条件が変わることがあります。
60 ℃ to 65 ℃ 60秒

*3 ROX Passive Reference の添加について

  • ROX補正を必要としない装置の場合、添加する必要はありません。
  • ROX補正を必要とするABI PRISM®7000/7700/7900HT, ABI7300, ABI GeneAmp®5700には終濃度 1X になるように添加してください。
  • ROX補正を必要とするABI Prism®7500, Mx3000P/3005/4000には終濃度 0.1X になるように添加してください。

実験例1: 粗抽出DNA溶液からのトウモロコシ内在性遺伝子(SSIIb)の検出

トウモロコシ種子から使用例に従って粗抽出DNA溶液を得た。得られた粗抽出DNA溶液を用いて、トウモロコシ内在性遺伝子SSIIb検出するプライマー対およびプローブ(HEX/TAMRA)を用いて増幅の確認を行った。なお、この実験例では、Internal Positive Control(IPC)としてプラスミドDNAをPCR反応液へ添加し、IPC検出用のプライマー対およびプローブ(FAM/TAMRA)を用いてIPCを検出する反応を同時(Duplex real-time PCR)に行った。

Template:トウモロコシ種子粗抽出DNA溶液
Probe:SSIIb-Taq(HEX/TAMRA), IPC-Taq(FAM/TAMRA)
定量PCR 試薬:DirectAce qPCR Mix plus ROX Tube
PCR volume:25 μL
サンプル数:n=3
装置:ABI PRISM® 7500
Run mode:9600 emulation mode
PCR condition:95°C 10分→(95°C 15秒→65°C 1分) x 45サイクル

Duplex real-time PCRの増幅曲線(Threshold Line=0.064、Base Line=3~15 cycle)

トウモロコシ種子粗抽出DNA溶液から良好にトウモロコシ内在性遺伝子SSIIbを検出することができた。

実験例2: ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の添加によるPCR阻害耐性の比較

PCR反応液に終濃度0.00~0.10%の範囲でSDSを添加し、GMダイズ(RRS)陽性コントロールプラスミド(25,000 copies相当)を鋳型として、GMダイズ(RRS)系統別DNA RRSオリゴヌクレオチドセット(製品コード:316-05611)を用いて、リアルタイムPCRを行い増幅の有無とそのCt値を確認した。

Template:GMダイズ(RRS)陽性コントロールプラスミド(25,000 copies相当)
SDS添加量(%, final conc.):NC, 0.01, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10
Probe:RRS-Taq(FAM/TAMRA)
定量PCR 試薬:DirectAce qPCR Mix plus ROX Tube
比較対象:A社製品、B社製品
PCR volume:25 μL
サンプル数:n=3
装置:ABI Prism® 7500
Run mode:9600 emulation mode
PCR condition:95°C 10分→(95°C 30秒→59°C 60秒) x 45サイクル

各SDS添加量におけるCt値の比較

A社製品は終濃度0.03%以上、B社製品は終濃度0.01%以上のSDSの存在により、PCRが阻害され増幅が認めらずCt値が得られなかったが、 DirectAce qPCR Mix plus ROX Tubeは終濃度0.10%のSDSが存在しても、PCRによる増幅が確認でき、そのCt値にほとんど影響がなかった。

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  • 掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
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